11-2. DNAの調製
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原理
細胞に多量に存在し、DNAと強く結合しているタンパク質をいかに変性、あるいは解離させ、溶解度や比重の差でDNAと分けるか 基本的に、どのような細胞でも同じ方法を用いることができる
操作の概要
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100 mM Tris-HCI バッファー(pH 8.0)
DNAを安定化させ、RNAを不安定化させるためpHを微塩基性にする
100~200 mM NaCl
DNA二本鎖を安定化させるために塩濃度を高める
1モルの分子数は$ 6.02\times10^{23}個(アボガドロ数)で、分子量100の分子の場合、100gで1モルとなる 1 mM EDTA
遠心分離すると
下層
水にあまり溶けず、かつ水より重いフェノール
上層
DNAは水に溶けたまま
中間層
変性タンパク質は不溶化している
4) 遠心分離でDNAを回収し、TEバッファー(10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA)に溶かして、DNA溶液を得る 得られたDNAには少量のRNAや多糖類が混入している可能性があるが、DNAをガラス棒に巻きつけて回収すると不純物が減る 基本的な操作はゲノムDNAと同じ
菌体をアルカリで溶解した後(DNAは変性する)急激に中和すると、ゲノムはランダムコイル状になり、タンパク質などを巻き込んで沈殿するという原理 界面活性剤で溶解した菌体を煮沸し、ゲノムをタンパク質の凝集塊として除く この方法は主に小規模の抽出操作で使用される
3) DNAの精製
不純物を取り除き、DNAの純度を高めること
糖類など、電荷のない物質を除く場合、負の電荷をもつDNA(RNAも)を正の電荷をもつ濾紙(e.g. DEAEセルロース)に吸着させて回収、除去することができる 比重や分子量に基づき、遠心分離で精製する方法もある
タンパク質を除ききれない場合はタンパク質分解酵素で処理するか、再度フェノール抽出を行う https://gyazo.com/886ba7cbe0ccab64dabd3a49f442ce48
4) 核酸の濃度測定
二本鎖DNAの場合、吸光度0.02で1 μg/mL
純粋な天然のDNAは260 nmの吸光度が280 nmの吸光度の2倍ある
タンパク質は280 nmに吸光度のピークをもつ芳香族アミノ酸を含むため、280 nmに吸収極大を示す 一本鎖DNAは紫外線をより多く吸収するので、$ \mathrm{OD_{260}=0.03}で1 μg/mLと概算する
RNAは一本鎖だが、部分的に二本鎖構造をとるので、$ \mathrm{OD_{260}=0.025}で1 μg/mLと概算する
$ \mathrm{オリゴヌクレオチドの濃度(pmol/\mu L)=OD_{260}\times\frac{100}{1.5N_A+0.71N_C+1.2N_G+0.8N_T}}
memo: 吸光度とOD
長さ$ Lcmの容器に濃度$ c(mol/L)の物質を含む溶液があり、そこに光が$ l_0の強さで入り$ lで出た場合、下式が成り立つ
$ A=\log(l_0/l)=\epsilon\ Lc
$ \epsilonは物質固有の値でモル吸光係数($ \mathrm{L/mol\cdot cm})、Aを吸光度という